| 地址：重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（400016） 重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所（400016） 摘 要：蛋白激酶C（Protein Kinase C,PKC）是一類由多種同工酶組成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族。PKC處于磷脂酰肌醇代謝的中心環(huán)節(jié)，與細(xì)胞的增殖、分化、神經(jīng)傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)節(jié)及腫瘤發(fā)生等病理生理過程有著密切的聯(lián)系。近年來研究表明，PKC在缺血性腦損害發(fā)病機(jī)制中起著較為重要的作用。本文擬就PKC同工酶概況及與腦缺血關(guān)系的研究現(xiàn)狀作一綜述。 關(guān)鍵詞：蛋白激酶C 同工酶 腦子缺血 PKC是最早被確認(rèn)的蛋白激酶之一。1977年Nishizuka等首先將在鼠腦組織中的蛋白激酶確認(rèn)為PKC，發(fā)現(xiàn)其具有組蛋白激酶活性，并能被限制性蛋白水解酶所激活。隨后的研究證實(shí)，PKC在神經(jīng)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)中，起著較為關(guān)鍵的作用。 1 PKC的生物學(xué)特性 1.1 PKC同工酶的分類及分布[1，2] PKC是一類鈣、磷脂依賴性磷酸化酶，廣泛存在于動(dòng)物、微生物等有機(jī)體內(nèi)，并分布在兒科所有的組織和器官中。迄今為止，根據(jù)同工酶的結(jié)構(gòu)、酶的特性、激活劑的不同等將其分為四大類至少十三種PDC亞型：cPKCs（classical PKC）:α、βI、βⅡ、γ；nRKCs(novel PKC):τ/η、δ、ε、θ、μ；aPKCs(atypical PKC):τ/λ、ζ；PRKs(PKC-Related-Kinase):PRK1、PRK2。 PKC分布極為廣泛，各種同工酶的分布又各有其特殊性。在腦組織中至少已發(fā)現(xiàn)有7種同工酶存在，而PKCγ為腦和脊髓所獨(dú)有；PKCδ、PKCε、PKCζ等在腦組織中含量非常豐富。 1.2 PKC同工酶的基本結(jié)構(gòu)[1～5] PKC為一條單鏈多肽，對(duì)PKC同工酶cDNA分析表明，該多肽鏈氨基端序列為調(diào)節(jié)域（regulatory domain），羧基端序列為催化域（catalytic domain），兩者之間通過可被蛋白酶水解的“鉸鏈區(qū)”（hinge domain,即V3區(qū)）連接，該區(qū)在酶的激活過程中發(fā)生降解，從而使PKC活性部位暴露。調(diào)節(jié)域含有C1、C2/V0、V1和V2四個(gè)區(qū)，酶催化域含有C3、C4、V4及V5四個(gè)區(qū)。在C1的氨基端還含有假底物位點(diǎn)（pseudosubstrate site），PRKs無此區(qū)；PKCμ在氨基端還有引導(dǎo)（leader）和跨膜（trans-membrane,TM）兩段序列。PKC各同工酶V1區(qū)的結(jié)構(gòu)及組成的差異決定了各同工酶底物的多樣性。 1.3 PKC激活和限制性調(diào)節(jié)（down-regulation）[2，3] 由于假底物的存在，靜息狀態(tài)下的PKC均以無活性形式存在于細(xì)胞胞漿中。在外界刺激作用下，PKC移位（translocation）到細(xì)胞膜而被激活短暫的PKC激活，在信號(hào)傳導(dǎo)通路中所致的短期事件（如離子內(nèi)流、分泌等）方面起著重要作用；持續(xù)的PKC激活，可能在細(xì)胞增殖、分化及腫瘤發(fā)生等方面起著重要的作用；異常持續(xù)的PKC激活，可導(dǎo)致細(xì)胞功能失調(diào)節(jié)。PKC被激活后活性下調(diào)的現(xiàn)象稱為“PKC的限制性調(diào)節(jié)”，PKC的限制性調(diào)節(jié)可能與以下因素有關(guān)：①PKC的酶性降解：激活的PKC對(duì)Ca2+激活的中性蛋白酶（calpain）更敏感。②應(yīng)激釋放和/或激活內(nèi)源性PKC抑制劑（如多胺、神經(jīng)節(jié)苷酯等），可能參與了缺血條件下PKC活性的下調(diào)；③外界刺激信號(hào)激活磷酸酶，使膜磷脂結(jié)構(gòu)、組分發(fā)生改變，影響了PKC的活性；④降解率的增加可引起PKC的限制性調(diào)節(jié)。腦氙血誘導(dǎo)的PKC激活，隨后活性下降，可能與上述因素有關(guān)。 2 PKC同工酶與缺血性腦損害關(guān)系 在缺血性腦損害過程中，由于血液供應(yīng)中斷而發(fā)生一系列的細(xì)胞內(nèi)代謝異常，最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性甚至死亡。然而，這一代謝異常的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在哪里，尚不清楚。近年來人們發(fā)現(xiàn)PKC在其中起著較為重要的作用。 2.1 腦缺血后PKC活性的變化 在研究短暫閉塞胎盤血管對(duì)胎腦PKC調(diào)節(jié)的影響時(shí)，采用組蛋白磷酸化和PMA（PKC激活劑）結(jié)合方法發(fā)現(xiàn)PKC活性首先移位；當(dāng)閉背地里較長時(shí)間時(shí)，PKC活性下調(diào)[6]。用（3H）PKBu放射自顯影技術(shù)，觀察短暫缺血（20min）及再灌流時(shí)PKC活性變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)海馬CA1區(qū)放射活性增加，再灌流6～12h達(dá)最高，再灌流7d放射活性下降[7]。然而，Hara等[8]在線栓法MCAO缺血/再灌流SV-129大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)再灌流1h[3H]PDBu放射活性明顯減少到對(duì)側(cè)的40～50%，3～7d后下降到對(duì)照組的20%。國外其他學(xué)者也有類似報(bào)道。有學(xué)者提出[9]，出現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異是由于：缺血刺激所致PKC移位可能發(fā)生在缺血早期，因而表現(xiàn)為PKC活性的升高；在較長時(shí)間或持續(xù)的缺血刺激后，由于有PKC限制性調(diào)節(jié)機(jī)制的參與，因而表現(xiàn)為PKC活性的升高；在較長時(shí)間或持續(xù)的缺血刺激后，由于有PKC限制性調(diào)節(jié)機(jī)制的參與，因而表面為PKC活性下降。當(dāng)然，也可能與檢測(cè)方法、動(dòng)物種屬及模型等因素有關(guān)。但上述結(jié)果均提示PKC參與了缺血性腦損害的發(fā)生、發(fā)展，特別是短暫性腦缺血發(fā)生后，PKC參與了缺血后的遲發(fā)生性損害和遠(yuǎn)隔部位的缺血性損害。[10] 2.2 缺血腦組織PKC同工酶的表達(dá)及基因調(diào)控 PKC與缺血誘導(dǎo)或谷氨酸興奮毒性誘導(dǎo)的神經(jīng)元變性有關(guān)，Buchner[11]等用谷氨酸、PMA作比較，觀察培養(yǎng)海馬神經(jīng)元內(nèi)PKC同工酶的再分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有PKCα、γ對(duì)谷氨酸有應(yīng)答，其他均少有應(yīng)達(dá)。采用亞細(xì)胞分離術(shù)和同工酶牧民性抗體的Western blot、激光共聚焦掃描電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)觀察到谷氨酸、PMA對(duì)上述兩種同工酶再分布有不同的作用：PMA導(dǎo)致兩者向膜片段移位，谷氨酸引起細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高，從而導(dǎo)致兩者向細(xì)胞骨架移位；免疫細(xì)胞化學(xué)揭示谷氨酸引起PKCγ主要向胞漿內(nèi)細(xì)胞骨架樣結(jié)構(gòu)移位，而PKCα再分布到胞膜和進(jìn)入細(xì)胞核，后者可能揭示PKC在興奮毒性損害中起了重要作用。Islam等[12]觀察蒙古沙土鼠不全性腦缺血PKCγ的分布，發(fā)現(xiàn)缺血后3h，在新皮質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量PKCγ陽性神經(jīng)元，6～12h達(dá)高峰，7d后不能檢測(cè)出，提出PKCr在海馬和新皮質(zhì)的這種變化規(guī)律可能與不全性腦缺血后調(diào)控突觸效率有關(guān)。用Westem bolt及免疫組化技術(shù)觀察狗不全性腦缺血，也發(fā)現(xiàn)缺血神經(jīng)元損害的發(fā)生率隨PKC活性的增加而增加，而且，海馬CA1、CA4和小腦的PKCα蛋白表達(dá)增加，PKCβ、PKCγ無變化，說明PKC參與了缺血性神經(jīng)元損害過程，且具有同工酶特異性[13]。 Savithiry等[14]采用沙土鼠短暫性缺血及再灌注動(dòng)物模型，缺血后10min再灌注，運(yùn)用cDNA雜交技術(shù)，檢測(cè)了前腦PKC同工酶δ、ε、ζ的mRNA表達(dá)，在再灌注1、6和24h三種同工酶的mRNA表達(dá)均升高，以δ、ζ明顯；3d后恢復(fù)至正常水平，并持續(xù)到第7d。Miettinen等[15]運(yùn)用原位雜交技術(shù)及免疫印跡（immunoblotting）技術(shù)，觀察線栓法MCAO缺血再灌流Wistar大鼠PKCα、β、γ、δ、ε、ζmRNAs及蛋白表達(dá)的變化規(guī)律：在梗塞中心缺血30min再灌充4h上述同工酶mRNA水平降低，再灌流12h完全消失；在梗塞周邊區(qū)，再灌流4、12、24h僅有PKCδ mRNA水平升高，再灌流3～7d，梗塞周圍區(qū)（ischemic penumbra，缺血半影區(qū)）PKCδ mRNA水平也增加，而且，再灌注其（第2d）缺血周圍區(qū)PKCδ蛋白表達(dá)及陽性神經(jīng)元數(shù)目均增高，且MK-801能抑制PKCδ mRNA水平及蛋白表達(dá)，因此PKCδ可能是通過調(diào)控NMDA受體而起缺血性腦保護(hù)作用。但其他學(xué)者運(yùn)用RT-PCR技術(shù)及同樣的動(dòng)物模型（缺血5min）觀察到cPKCs中僅有PKCγ mRNA水平在再灌流早期（3h內(nèi)）升高達(dá)對(duì)照的145%，隨后降 低60～65%，3d后回到對(duì)照水平，造成上述結(jié)果的差異，可能是因?yàn)槿毖獣r(shí)間不同等因素所致[16]；盡管如此，這些結(jié)果表明PKCδ、PKCγ可能在缺血性腦損害中起了重要作用。 2.3 PKC抑制劑對(duì)缺血性腦損害的保護(hù)作用 腦組織中含有豐富的PKC（尤其在突觸前末端），它可能在神經(jīng)元信息傳遞、遞質(zhì)釋放等方面起著重要作用。雖然目前尚缺乏PKC同工酶特異性抑制劑，但一些工具藥已開始用于探討PKC在腦缺血病理、生理機(jī)制中的作用。于四血管結(jié)扎的大鼠缺血再灌流模型中可觀察到PKC活性在顆粒片段中而不是在胞漿片段中迅速增加，其中以PKCγ水平增加明顯；運(yùn)用谷氨酸拮抗可使其水平降低，與缺血再灌流中谷氨酸釋放的減少有關(guān)[17]。降低體溫可以減少缺血誘導(dǎo)的PKC易位和抑制期活性，并減少缺血誘導(dǎo)的PKC易位和抑制其活性，并減少缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放。在缺血過程中，有PKC激動(dòng)劑（PDBu）和拮抗劑（staruosporine）存在或缺乏時(shí)，運(yùn)用微透析技術(shù)觀察谷氨酸的變化情況：發(fā)現(xiàn)低溫降低了紋狀體內(nèi)細(xì)胞外谷氨酸水平。腦缺血時(shí)，低溫（33℃）狀態(tài)下，給予PDBu后，谷氨酸的水平從0.3mumol/L升高到4.8mumol/L；正常體溫下給予Staurosporine可明顯減少谷氨酸水平。上述結(jié)果表明：腦缺血過程中，紋狀體內(nèi)細(xì)胞外谷氨酸水平的升高與溫度呈依賴關(guān)系，PKC在其中發(fā)揮了重要作用；Staurosporine可通過抑制PKC的活性發(fā)揮缺血性腦保護(hù)作用，其機(jī)制可能與低溫腦保護(hù)作用相似[18]。自發(fā)性高血壓大鼠短暫前腦缺血模型中，運(yùn)用高效液相色譜法觀察PKC抑制劑對(duì)缺血誘導(dǎo)的氨基酸釋放的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈閉塞導(dǎo)致谷氨酸、精氨酸、�；撬崦黠@增加（分別比對(duì)照增加21倍、19倍、16倍），GABA也有所增加。給予H7后上述指標(biāo)分別下降到對(duì)照的3、3、4倍；HA1004對(duì)谷氨酸、精氨酸、GABA影響較小，而牛磺酸的釋放能被HA1004抑制，但其作用較H7小，產(chǎn)生這種差異可能是由于興奮性和抑制性氨基酸的釋放機(jī)制不同[19]。上述結(jié)果顯示，缺血性腦損害時(shí)PKC對(duì)氨基酸釋放起著重要的調(diào)控作用，并可能具有同工酶特異性。PKC抑制劑還能減輕缺血性腦水腫，在結(jié)扎沙土鼠單側(cè)頸總動(dòng)脈及閉塞SD大鼠MCA制成單側(cè)腦水腫病理模型中，觀察兩種PKC抑制劑H7和苦參堿對(duì)腦水腫的影響，發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)兩種模型所致腦水腫均有防治作用。用PKC抑制劑Staurosporine直接注入海馬CA1治療大鼠和沙土鼠腦缺血，發(fā)現(xiàn)可以明顯改善缺血/再灌流引起的病理變化，減少細(xì)胞死亡數(shù)，這種神經(jīng)元保護(hù)作用有劑量依賴關(guān)系。 小結(jié) PKC同工酶種類較多，是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中最龐大的一類，其同工酶的組織分布、結(jié)構(gòu)、功能、活性以及基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制不同，并且與體內(nèi)多種病理生理過程的調(diào)節(jié)有關(guān)。因此開發(fā)PKC同工酶特異性拮抗劑，將會(huì)在腫瘤、內(nèi)分泌疾病，尤其是在心腦血管疾病的治療中發(fā)揮重要的作用。 參 考 文 獻(xiàn) 1 Mellor H,et al.Biocherm J,1998332:281 2 Nishizuka Y.FASEB J,19959:484 3 Hofmann J.FASEB J,199711:649 4 Flynn P,et al.J Biol Chem,1998273(5):2698 5 Wu SL,et al.J Biol Chem,1998273(5):1130 6 Yavin E,et al.J Neurochem,199565:2594 7 Onodera H,et al.Brain Res,1998481:1 8 Hara H,et al.Brain Res,1997774:69 9 Tohyama Y,et al.Brain Res,1997750:155 10 Harada K,et al.J Neurochem,199972(6):2556 11 Buchner K,et al.Mol Brain Res,199964(2):222 12 Islam N,et al.Indian J Physion Pharmacol,199539(1):37 13 Sieber FE,et al.Stroke,199829:1445 14 Savithiry S,et al.Mol Chem Neuropathol,199421:1 15 Miettinen S,et al.J Neurosci,199616(19):6236 16 Zablocka B,et al.Brain Res,1998779:254 17 Saluja I,et al.Neurochem Res,199924(5):669 18 Boris-Moller F,et al.Mol Chem 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